Nature Communications, том 14, номер статьи: 4407 (2023) Цитировать эту статью
1593 Доступа
17 Альтметрика
Подробности о метриках
Острое повреждение почек (ОПП) является важным фактором риска хронической болезни почек (ХБП), но основные механизмы неспособного восстановления канальцев и перехода ОПП-ХБП до конца не изучены. В этом исследовании мы стремились к динамическому отслеживанию повреждения и ремоделирования канальцев, чтобы понять, может ли очаговое повреждение при ОПП распространяться с течением времени. Здесь мы представляем модель ОПП, в которой мы визуализировали ишемию только половины почки. Используя серийную прижизненную 2-фотонную микроскопию и генетическую идентификацию циклических клеток, мы отслеживали динамическое ремоделирование тканей в пост- и неишемических областях почек одновременно и в течение 3 недель. Пространственный и временной анализ циклических клеток относительно начальной гибели некротических клеток продемонстрировал выраженное распространение и экспансию повреждений в ненекротические области ткани, что предсказывало атрофию канальцев с экспрессией эпителия VCAM1. Таким образом, наш продольный анализ повреждения, ремоделирования и судьбы канальцев дает важную информацию о патологии ОПП.
Острое повреждение почек (ОПП) определяется как внезапное снижение функции почек, которое часто вызвано острым повреждением канальцев1. В зависимости от тяжести инсульта функция почек у пациентов может восстановиться. Однако к настоящему времени точно установлено, что у пациентов с ОПП сохраняется высокий риск развития хронической болезни почек (ХБП) в дальнейшем2,3. Механизмы этого перехода ОПП-ХБП до конца не изучены3, но они связаны с дисфункцией эндотелиальных клеток4,5, рекрутированием интерстициальных иммунных клеток и воспалением6,7,8, интерстициальным фиброзом почек9,10 и неполным восстановлением эпителия канальцев11,12. Проксимальные канальцы почек (ПТ) являются основным местом повреждения при ишемически-реперфузионном повреждении (ИРИ) и подвергаются значительному ремоделированию13. При повреждении PT-клетки могут дедифференцироваться с экспрессией de novo маркеров, таких как Kim-1, Cd44 и виментин, пролиферировать и, в конечном итоге, повторно дифференцироваться в функциональные PT-клетки14,15,16. Тем не менее, в своем дедифференцированном состоянии они также участвуют в паракринных сигнальных путях, усиливая интерстициальное воспаление, рекрутирование миофибробластов и последующее фиброзное ремоделирование14,17,18,19. Недавние исследования по секвенированию одиночных клеток, полученные из почек IRI, также показали, что подмножество этих дедифференцированных PT-клеток находится в состоянии неудавшейся репарации с усилением воспалительной передачи сигналов8,11. Наконец, вызванная ОПП гибель некротических клеток может непосредственно способствовать усилению воспаления тканей и способствовать дальнейшему повреждению20,21.
Чтобы предотвратить переход ОПП в ХБП, нам необходимо лучше понять, как процессы повреждения тканей и ремоделирования связаны с успешным или неуспешным выздоровлением. Однако для изучения этого существуют ограниченные данные. Биопсии пациентов с ОПП обычно не собираются и демонстрируют значительную гетерогенность по времени взятия биопсии22. Кроме того, исследования ОПП на животных обычно включают сбор органов для дальнейшего анализа ex vivo. Таким образом, высокодинамичные процессы ремоделирования, вызванные ОПП, реконструируются по единичным снимкам, полученным от разных животных и в разные моменты времени. Это ограничивает понимание динамических межклеточных взаимодействий и их влияния на судьбу нефронов. Фактически, несколько довольно фундаментальных вопросов о том, как почечная ткань может регенерировать после повреждения, до сих пор остаются без ответа или спорно обсуждаются: Какие клетки пролиферируют в ответ на повреждение ткани? Насколько велика способность восстановления поврежденной почечной ткани? Как влияет на неповрежденную ткань почки соседнее очаговое повреждение? Может ли травма распространяться со временем?
В этом исследовании мы объединили серийную прижизненную 2-фотонную микроскопию (2PM) с генетической идентификацией циклических клеток23 и модель частичного ишемически-реперфузионного повреждения (частичный IRI), которая была задумана для изучения воздействия некротических клеток на соседние неповрежденные ткани. Серийная визуализация почек с частичной ИРИ в течение 3 недель предоставила парные данные о повреждении и ремоделировании канальцев и впервые связала начальную некротическую гибель клеток с локальными участками пролиферации канальцев и, в конечном итоге, судьбой канальцев. Таким образом, наши данные идентифицировали ранние проксимальные канальцы как ключевое место некротического повреждения и источник образования гранулярных цилиндров, что было связано с распространением повреждения ниже по ходу и развитием атрофии канальцев.
25 μm) from any propidium iodide (PI)+ cell detected on day 0 (n = 145, 184 and 37 segments from 4 mice for PT-S1, PT-S2, and DCT/CD, respectively); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical test: two-sided paired t-test with p < 0.05 considered significant (Supplementary Extended Statistics.k). d Same dataset as in (c) displayed to reveal distinct locations of proliferating tubule cells in different tubule segments over days after partial IRI (n = 4 partial IRI mice; detailed information on segment number/group provided in Supplementary Table 3); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.m). e Volumetric quantification of tubular GFP expression (% of total nuclei/ segment) clustered by necrotic thresholds (n = 223, 140, 157 PT-S1 segments and 250, 237, 103 PT-S2 segments for non-necrotic, moderate, and severe, respectively, from 6 mice); mean ± 95% CI with scatterplots. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.n). f Linear regression of PI+ nuclei (% of total nuclei/segment) at day 0 and cumulative GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment) from days 1, 2, and 3 for PT-S1 and PT-S2 segments (n = 144 and 180 from 4 mice). Fit (slope*x + intercept, plotted with 95% CI), R2 and Pearson’s coefficient (r) are reported for both. #: significant difference of slope and intercept from zero. *: significance test across groups, p-values from two-sided test. */#: p < 0.05; **/##: p < 0.01; ***/###: p < 0.001./p>20% necrotic cells at day 0). Consistent with the findings above, we observed significantly higher GFP expression in non-necrotic and moderately necrotic PT-S2 segments on days 2 and 3 as compared to respective PT-S1 (Fig. 4e). Among severely necrotic segments, PT-S1 segments proliferated more than PT-S2 segments on day 1. However, GFP expression in severely necrotic PT-S2 segments rapidly increased from day 2 and exceeded that observed in PT-S1 segments on days 3 and 7 (Fig. 4e). Finally, we aimed to evaluate if PT-S1 and PT-S2 displayed different capacities to proliferate upon necrotic cell death of a given degree. Thus, we performed a linear regression of PI-positive nuclei (% of total nuclei) observed on day 0 and the cumulative number of GFP-positive nuclei (% of total nuclei) observed on days 1 to 3 after partial IRI. For both PT-S1 and PT-S2 segments, a significant correlation between the initial number of necrotic cells and the subsequent proliferative response was detected (Fig. 4f). Of note, there was no significant difference in the slopes of the linear regressions, indicating a comparable necrosis-induced proliferative response in PT-S1 and PT-S2 segments (Fig. 4f). However, we detected a significantly higher intercept in the linear regression of PT-S2 segments (Fig. 4f), which demonstrated a population of PT-S2 segments that proliferated in absence of preceding necrotic injury. In contrast, the intercept of the PT-S1 linear regression equation was not statistically different from zero, confirming that proliferation in these segments strictly depended on the presence of initial necrotic injury./p>1% PI+ necrotic cells at day 0 was classified as necrotic; mean ± 95% CI with scatterplots. Statistical test: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test, no adjustment for multiple comparisons (Supplementary Extended Statistics.o). e Linear regression of luminal granular cast area (% of total segment cross-sectional area) and GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment, assessed in 3D) measured 24 h later in the same segment and proliferating outside a 25 µm radius from any PI+ nucleus (n = 179 and 184 for non-necrotic and necrotic segments from 4 and 3 mice, respectively). Fit (slope*x + intercept, plotted with 95% CI); R2 and Pearson’s correlation coefficient (r) are reported for both. #: significant difference of slope and intercept from zero. *: significant difference between the segment types, p-values from two-sided test, */#: p < 0.05; **/##: p < 0.01; ***/###: p < 0.001./p>1% PI+) (c) and GFP+ nuclei (% of total nuclei/ segment) at day 3/4 (d), in recovered and atrophic tubule segments, respectively (c: n = 89 and 92 segments from 4 and 3 mice; d: n = 124 and 168 segments from 4 mice, respectively); mean ± 95% CI with scatterplot. Statistical tests: linear mixed-effect model, p-values from two-sided test (Supplementary Extended Statistics.q). e Correlative in vivo and ex vivo 2-photon microscopy images of CycB1-GFP kidneys 21 days after partial IRI reveal selective tubular VCAM-1 immunostaining (blue, arrows) in atrophic tubules (ω). Scale bar: 100 µm. f, g Tubular fate distribution (%) across partial IRI areas (f: n = 82,232, and 153 segments for Not-IR, Mid, and IR from 4, 6, and 5 mice, respectively), and days after partial-IRI (g: n = 103 and 106 for recovered and atrophic tubules from 6 mice, respectively). h Binary regression of luminal granular cast area (in % of total segment cross-sectional area) at day 3/4 and respective tubule fate (0 = non-atrophy; 1 = atrophy), (n = 237 segments from 4 mice, respectively). Fit (slope*x + intercept); R2, and effect size as odds ratio (OR) for the predictor are reported. *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001./p>1% of total nuclei) that regained morphologically intact epithelium. Atrophic segments were defined by a collapsed tubular lumen and severely fragmented epithelial appearance (Supplementary Fig. 2). (9) Dynamic PT-S1 function was assessed as albumin reuptake capacity expressed as the mean fluorescent intensity ratio of Alexa594-albumin in the apical cytoplasmic region of PT-S1 segments and in peritubular capillaries (n = 170)./p>
Русский
English
Français
Deutsch
Español
Italiano
Português
日本語
한국어