Сравнение альтернативной технологии очистки моноклональных антител

Джек Викальви, главный научный сотрудник J2 Biopharm Associates LLC

За последние 15 лет мы увидели больше улучшений в развитии последующих процессов, чем произошло за предыдущие 35 лет. Это первая из двух частей обзора избранных инновационных продуктов и подходов с универсальным значением, которые способствовали усовершенствованиям, позволяющим производить крупномолекулярные биологические терапевтические средства, такие как моноклональные антитела (МАТ) и вирусные векторы, с более высокими показателями извлечения и чистоты.

В части 1 мы рассмотрим, как эти продукты меняют способ производства моноклональных антител, где их можно использовать в текущих схемах разработки процессов и какие преимущества они дают по сравнению с предыдущими методами. Мы затрагиваем ситуационную экономику, которая стимулирует использование этих инновационных продуктов или подходов. Наконец, мы сосредоточимся на моделях масштабирования GMP для практических целей: если они не масштабируются, не имеет значения, насколько они хороши.

Блок-схемы процесса mAb

Очистка урожая биореактора является первым шагом в последующем процессе; это не последний этап предварительного процесса, поскольку по сути это очистка лекарственного вещества. Этот шаг имеет решающее значение для эффективной очистки интересующего продукта; Традиционным методом является простая фильтрация собранного материала по размеру. Однако, в зависимости от требуемых критических показателей качества (CQA), фильтрация по размеру сама по себе может оказаться уже недостаточной или неизбежной.

Использование заряженных фильтрующих устройств (таких как фильтры 3M SP и ZB или мембраны Millipore DOHC, COHC и XOHC) может привести к предварительному удалению сильно заряженных примесей, таких как ДНК клетки-хозяина (hcDNA) и некоторые белки клетки-хозяина. (HCP) и вирусы, что значительно повышает эффективность последующего улавливания и, следовательно, первоначальное извлечение и чистоту. В ситуациях, когда жизнеспособность клеток во время сбора низкая (<50%), наблюдается заметное увеличение остатков клеток-хозяев, включая ДНК, HCP (включая протеолитические ферменты), а также внутриклеточные или эндогенные вирусные частицы, дополнительное уменьшение которых может быть достигнуто за счет заряженной мембранной фильтрации. становятся значимыми на последующих стадиях очистки. В ситуациях, связанных с низкой жизнеспособностью клеток, добавление эндонуклеазы, предпочтительно в биореакторе, за 1 час до сбора, будет способствовать уменьшению длины цепи ДНК и значительному улучшению фильтруемости. Эндонуклеаза продолжает работать во время осветления вплоть до захвата (обычно от 3 до 8 часов, в зависимости от условий захвата и скорости загрузки).

В большинстве случаев моноклональные антитела не связываются с анионными матрицами; однако может оказаться необходимым отрегулировать pH и/или проводимость урожая (опять же, предпочтительно в биореакторе), в зависимости от интересующей мишени, чтобы предотвратить связывание с фильтром или подготовить мишень для захвата на последующих этапах. Условия оптимального извлечения продукта с максимальным снижением содержания примесей необходимо будет определять эмпирически для каждого моноклонального антитела.

При выборе глубинных фильтров подходящего размера центрифугирование в лучшем случае становится излишним; кроме того, существует проблема масштабирования и проверки очистки, даже при использовании одноразовых ведер (затраты на капитальное оборудование и его техническое обслуживание, образование аэрозолей и утилизация использованных ведер). В тех случаях, когда фильтрация нецелесообразна, использование хроматографии в расширенном слое может быть более осуществимым и более экономичным вариантом (см. технологию Upfront Rhobust EBA).

Обычно на этапе захвата используется смола с белком А. Однако не все фрагменты белка А одинаковы. Некоторые связывают разные моноклональные антитела с различной степенью специфичности и авидности; поэтому любая смола с белком А, которую вы выберете, должна определяться эмпирическим путем. Также следует учитывать смоляную матрицу; к ним относятся мягкие смолы, такие как агароза и некоторые метакрилаты, и жесткие смолы, такие как полистирол или керамика. Все они имеют обширные нормативные файлы.

Основные различия между мягкими и жесткими смолами заключаются в линейной скорости и расходе буфера во время работы. Агароза представляет собой мягкую смолу, требующую опоры на стену, иначе слой провисает, образуя «улыбку», которая создает передний край во время элюирования в колонках шириной более 5 см. Он также является медленнодиффузионной средой и теряет емкость и целостность слоя при скорости выше 300 см/ч. Кроме того, из-за своей диффузионной природы он требует тщательной промывки во время замены буфера, особенно перед элюированием. Капто-смолы представляют собой сшитую агарозу, которая может облегчить некоторые из этих проблем; однако базовая матрица по-прежнему представляет собой агарозу, требующую интенсивной промывки и медленной скорости потока, чтобы обеспечить диффузию. Жесткие смолы легче упаковывать, они требуют гораздо меньше промывки и сохраняют целостность слоя без опоры на стену. Эти смолы также можно эксплуатировать при линейных скоростях от 800 до 1200 см/ч без значительной потери производительности.