Высокоэффективная схема подготовки библиотеки из одного

Том 13 научных докладов, Номер статьи: 13913 (2023) Цитировать эту статью

389 Доступов

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Хотя методы получения библиотеки секвенирования из двухцепочечной ДНК хорошо известны, методы из одноцепочечной ДНК (оцДНК) недостаточно изучены. Кроме того, существующие методы имеют ограничения по эффективности и урожайности. Поэтому мы разработали высокоэффективную процедуру подготовки библиотеки секвенирования из оцДНК. В этом методе первое маркирование оцДНК адаптером осуществляется с использованием лигирования оцДНК (TACS) с помощью терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы (TdT), о котором мы недавно сообщили. После синтеза комплементарной цепи с использованием оцДНК, меченной адаптером, выполняется маркировка второго адаптера с помощью лигирования адаптера на основе топоизомеразы I вируса коровьей оспы (VTopoI или TOPO). С дополнительными этапами деградации, репрессии и удаления димера адаптера предлагаемая схема TACS-TOPO реализует подготовку библиотеки секвенирования без димера адаптера из образцов оцДНК размером 24 пг. Схема TACS-TOPO была успешно применена для анализа бесклеточной ДНК с приготовлением библиотеки без амплификации из 50 мкл сыворотки человека. Модифицированная схема TACS-TOPO также была применена к ДНК, извлеченной из костей древних людей, что дало в два-восемь раз больше выходов библиотеки, чем при использовании традиционного протокола подготовки библиотеки. Также описаны процедуры получения VTopoI и его комплекса с двухцепочечным олигонуклеотидным адаптером. В целом, предлагаемая схема TACS-TOPO может облегчить практический и чувствительный анализ секвенирования оцДНК.

Хотя доступно множество эффективных методов подготовки библиотеки секвенирования из двухцепочечной ДНК (дцДНК)1,2,3, для одноцепочечной ДНК (оцДНК) имеются ограниченные методы. На сегодняшний день установлены только три основных принципа подготовки библиотеки секвенирования из оцДНК. Первый подход включает терминальную дезоксирибонуклеотидилтрансферазу (TdT), опосредованную гомополимерным хвостом к 3'-концу оцДНК; затем хвост используется в качестве сайта прайминга для преобразования целевой оцДНК в дцДНК, после чего второй адаптер помечается ДНК-лигазой Т4. Подготовка библиотек с помощью TdT очень эффективна, и некоторые производители предоставляют наборы для подготовки библиотек, основанные на этом принципе. Однако длинный хвост может стать препятствием для последующего анализа секвенирования.

Второй метод основан на лигировании оцДНК, катализируемом РНК-лигазой, которая присоединяет 5'-фосфорилированный адаптер к 3'-концу оцДНК. Например, группа Мейера разработала метод, основанный на CircLigase II5,6. После лигирования адаптера оцДНК преобразуется в дцДНК с последующим мечением второго адаптера ДНК-лигазой Т4. Хотя РНК-лигаза может соединить две молекулы оцДНК, эффективность реакции ограничена менее чем несколькими процентами. Поэтому выход приготовления библиотеки с использованием РНК-лигазы весьма ограничен.

Третий подход использует ДНК-лигазу Т4 для лигирования оцДНК7. В этом методе используется двухцепочечный адаптер с одноцепочечным случайным гексамером на одном конце. Если случайный гексамер совместимо гибридизован с концом целевой оцДНК, разрыв на частично двухцепочечном конце адаптера может быть запечатан с помощью ДНК-лигазы Т4. Эта процедура, основанная на шинированном лигировании, называется ssDNA2.0 и показывает эффективность, превосходящую метод на основе CircLigase II7. Хотя методы, основанные на РНК-лигазе и ДНК-лигазе Т4, могут создавать чистые соединения с целевой оцДНК, их низкую эффективность при подготовке библиотеки еще предстоит решить.

Чтобы улучшить подготовку библиотеки последовательностей из оцДНК, мы разработали метод эффективного адаптерного мечения оцДНК, называемый лигированием одноцепочечной (оц) ДНК (TACS) с помощью терминальной дезоксирибонуклеотидилтрансферазы (TdT)8. При лигировании TACS целевая оцДНК сначала связывается с несколькими аденилатами с использованием TdT в процессе, называемом рибохвостом, после чего происходит опосредованное РНК-лигазой адаптерное мечение оцДНК с рибохвостом. Риботейлинг 3'-конца оцДНК позволяет ей вести себя как РНК, что значительно повышает эффективность лигирования оцДНК РНК-лигазами. Соответственно, лигирование TACS позволяет пометить адаптером более 80% 3'-конца целевой оцДНК8. Примечательно, что реакция хвоста TdT с рибонуклеотидом аутоингибируется после удлинения 1–3 нуклеотидов9, что приводит лишь к минимальному прерыванию последующего анализа секвенирования.